从肝脏组织中制备细胞核
发布日期：2022-10-27 浏览次数：824
— Cell experiment —
从肝脏组织中制备
细胞核
一
材料与仪器
大鼠、裂解缓冲液、浓蔗糖溶液、
超速离心机、组织研磨器
二
实验步骤
01
配制裂解缓冲液和浓蔗糖溶液（PMSF 在使用前添加），冰上放置。
配制裂解缓冲液：
0.25 mol/L 蔗糖网织红细胞标准缓冲液（RSB）
0.25 mol/L 蔗糖（超级纯）
10 mmol/ Tris-HCl (pH7.4)
10 mmol/L NaCl
3 mmol/L MgCl2
1 mmol/L DTT
0.5 mmol/L PMSF ( 用前从溶于乙醇的 100 mmol/L 贮存液中添加）
配制浓蔗糖溶液：
2 mol/L 蔗糖 RSB
2 mol/L 蔗糖（超级纯）
10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)
10 mmol/L NaCl
3 mmol/L MgCl2
1 mmol/L DTT
0.5 mmol/L PMSF（用前从溶于乙醇的 100 mmol/L 贮存液中添加）
02
超速离心机（Beckman 的与 SW28 转头兼容型）和转头预冷到 4℃。
03
将组织研磨器（55 ml 的研磨腔；Thomas C 型腔和锯齿型 Teflon 研杵，3431-E25）。量筒和烧杯放到冰上。
04
在一冰桶的冰上放一玻璃盘。
05
在一冰桶的冰上放一玻璃盘。
06
在一玻璃盘上，用剃刀片快速去除结缔组织，将20g肝脏切成大约1cm3 的小块。
07
将肝脏碎块装入含 40ml ( 两倍体积）裂解缓冲液的冷的烧杯中。
08
将大约30ml这种肝脏碎块和缓冲液混合物倒入预冷的组织研磨器腔中。
09
将研杵连到推进器，便其滑到研磨腔中，直到触到缓冲液面。然后握住研磨腔侧面，打开推进器。逐渐加大推进器速度直至其最高速度，同时稳定地将研磨腔沿转动的研磨向上推进。当研杵到达研磨腔底部时，向下拉研磨腔直到所有匀浆都从研杵旁通过，然后再将研磨腔沿研杵推回。重复该过程 5~10 次后关掉推进器。
10
检查细胞的裂解效率：
(1) 将研磨腔放到冰上，取出 10 μl 裂解液，用 1 ml 裂解缓冲液稀释。
(2) 取 2.7 μl 稀释后的裂解液加到载玻片上，再加上 2.7 μl 含 10 μg/ml Hoechst 染料（33258 10 mg/ml；Molecular Probes 或其他供应商）的裂解缓冲液，然后用一 18 mm2 的 1 号盖玻片将液滴盖上。
(3) 比较亮的 DNA 染色的细胞核与同一视野的相图。
(4) 如果裂解细胞数少于 95%，加大推进器速度，继续研磨样品 5~10 次。
11
在一漏斗中装入 4 层粗孔滤纸，放到一埋在冰浴中的量筒中，然后将匀浆倒进漏斗。
12
裂解剩余的肝脏碎块，匀浆通过滤纸过滤与其余裂解物样品混和，记录得到的裂解物体积。
13
将裂解物体积除以6，再从离心管体积（35~38ml) 中减去该体积。即可确定加入6个离心管中的浓蔗糖溶液的体积。在2mol/L RSB 溶液中加 PMSF 至终浓度为0.5mmol/Lol/L。取适当体积（通常25~30ml ) 加到离心管中，冰上放置。
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向离心管中加入浓蔗糖溶液和等体积裂解物（通常 7~9 ml )。加裂解物时，应将移液管头靠在离心管内壁上部使裂解物缓慢流下，这样可减少裂解物与蔗糖溶液的混和。
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将离心管放到预冷的转桶中，对面的转桶用裂解缓冲液平衡。
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转桶在SW28转头上装好，放进预冷的离心机中，23000g，4℃离心 30 分钟。
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吸出裂解物和蔗糖溶液，或者在一烧杯上将离心管倒转将液体倒出。用一无绒纸巾清除内壁上的残余物质，离心管放置于冰上。每管加入 2 ml 裂解缓冲液重新悬浮沉淀。
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将沉淀的重悬浮液集中到一个50ml的离心管（锥形或圆形底）中，加裂解缓冲液至50ml终体积，在医用离心管中1500g离心5分钟。
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吸出上清，细胞核沉淀重悬浮于 1 ml 的裂解缓冲液中。取出少量样品稀释 100 倍后在血球计数板上计数细胞核数目。
20
用裂解缓冲液将样品稀释到期望浓度的两倍，加入等体积甘油，放液氮中冷冻，-80℃保存。